Le procedure di crioconservazione

procedure di crioconservazione sono quelle che permettono alle cellule di essere conservati a tempo indeterminato utilizzando temperature estremamente fredde per sospendere le attività metaboliche . Ci sono due tipi principali di procedure di crioconservazione : equilibrio ( convenzionale congelamento lento ) e non -equilibrio o il congelamento ultra- rapido ( vetrificazione ) . Il termine vetrificazione deriva dal latino " vitreo " o vetroso . Entrambe le procedure utilizzano crioprotettivi con proprietà antigelo tipo per prevenire il danno cellulare durante il processo di congelamento . Una volta che le cellule vengono congelate o vetrificate , possono essere conservati indefinitamente immergendoli in azoto liquido , un fluido estremamente fredda con una temperatura di -196 C ( -321 F ) . Per ripristinare l'attività metabolica nella cellula dopo lo scongelamento , crioprotettori tossici devono essere rimossi dalla cella e il normale equilibrio acqua gradualmente ripristinati come la cella viene riportato ad una temperatura normale funzionamento . Panoramica

panoramica

procedure di crioconservazione sono quelle che permettono alle cellule di essere conservati a tempo indeterminato utilizzando temperature estremamente fredde per sospendere le attività metaboliche . Ci sono due tipi principali di procedure di crioconservazione : equilibrio ( convenzionale congelamento lento ) e non -equilibrio o il congelamento ultra- rapido ( vetrificazione ) . Il termine vetrificazione deriva dal latino " vitreo " o vetroso . Entrambe le procedure utilizzano crioprotettivi con proprietà antigelo tipo per prevenire il danno cellulare durante il processo di congelamento . Una volta che le cellule vengono congelate o vetrificate , possono essere conservati indefinitamente immergendoli in azoto liquido , un fluido estremamente fredda con una temperatura di -196 C ( -321 F ) . Per ripristinare l'attività metabolica in cella dopo lo scongelamento , crioprotettivi tossiche devono essere rimossi dalla cella e il normale equilibrio acqua gradualmente ripristinato come la cella è tornato a una temperatura normale funzionamento .
Cell- fattori specifici

la procedura utilizzata per crioconservare cellule o tessuto dipende da numerosi fattori tra cui la dimensione della cella , la quantità di fluido cellulare ( citoplasma ) e la complessità della cella ( singola cella o tessuto ) . Cellule con una grande quantità di citoplasma quali uova sono più difficili da crioconservare di cellule con citoplasma solo residuo , come spermatozoi . Crioconservazione di tessuto ovarico è più difficile perché sono presenti nel tessuto ovarico , ciascuno con diverse esigenze di congelamento ottimali almeno tre diversi tipi di cellule di varie dimensioni . Protocolli lento congelamento sono stati usati con successo con vari tipi di cellule . La vitrificazione è attualmente più efficace con il congelamento cella singola e meno efficace con i tessuti , ma la ricerca è ancora in corso per ottimizzare la vetrificazione dei tessuti .
Ruolo della crioprotettori

Il citoplasma una cella contiene acqua , che gira a cristalli di ghiaccio a temperatura di congelamento . Quando si forma il ghiaccio all'interno di una cella, la cella viene triturato e muore . Pertanto , il fluido nella cella deve essere rimosso prima di raggiungere temperature di congelamento per evitare danni cellulari . Vari tipi di fluidi antigelo ( crioprotettrici ) possono essere utilizzati per disidratare la cella prima del congelamento , compresi glicerolo , propandiolo , dimetil sulfoxde ( DMSO ) , etanolo e zuccheri come saccarosio e trealosio . Il tasso ottimale di raffreddamento ( e scongelamento ) dipende dal tipo di crioprotettore utilizzato e dalla caratteristica della cellula o tessuto sia ( o fosse) congelati . Crioprotettori sono tossici per metabolizzare cellule in modo esposizioni cellulari ai crioprotettivi a temperature più calde metaboliche devono essere ridotti al minimo o evitati . Dopo lo scongelamento o riscaldamento delle celle , cryoprotectants devono essere completamente rimossi dalla cella prima attività metabolica viene ripristinato .
Equilibrium Versus non-equilibrio Crioconservazione procedura

Il tasso di gelo dipende dal fatto che il protocollo di congelamento è equilibrio o non basata equilbrio . Per le procedure di equilibrio , la velocità di congelamento ottimale si ottiene quando c'è un equilibrio tra la velocità con cui la cella viene disidratato di acqua e la velocità con cui l'acqua all'esterno della cellula si trasforma alla fase ghiaccio . Questi protocolli di equilibrio o di lento congelamento di solito prendono ore per completare e un computer viene utilizzato per eseguire un tasso freezer programmabile per assicurare che i tassi di congelamento sono esattamente come richiesto . C'è in genere un " hold " intervenire nel protocollo in prossimità della partenza per permettere la creazione manuale di cristalli di ghiaccio di avviamento o di " semina " nel fluido all'esterno delle cellule .

vetrificazione , viene utilizzato un approccio completamente diverso per congelamento che non si basa su rampe e raggiungere un equilibrio tra la disidratazione e la formazione di cristalli di ghiaccio . Vetrificazione è così ultra - rapido che manca il tempo sufficiente per la formazione di ghiaccio e il fluido cellulare viene convertito direttamente in una fase vetrosa o vetro , senza danneggiare la cella . Congelatori tasso programmabili non sono necessari perché la cella è immerso direttamente in azoto liquido estremamente freddo , raggiungendo uno stato vetroso istantanea .
Lento -Freeze procedura

Il primo passo di la procedura lento congelamento è quello di esporre la cellula di crioprotettore in modo graduale graduale per consentire lentamente equilibramento della cella con il crioprotettore mentre rilasciando acqua . Una volta che le cellule sono state cancellate della maggioranza di acqua cellulare , le cellule del fluido crioprotettore sono posti in un contenitore di qualche tipo , ad esempio una cannuccia , una fiala di vetro o un volume vial.The plastica di liquido che circonda le cellule per congelamento lento è in genere meno di un cucchiaino e può essere solo poche gocce . Il contenitore pre -marcato è riempito , sigillato e messo in un congelatore programmabile , che diminuisce lentamente la temperatura del contenitore lungo un periodo di minuti o ore a temperature molto basse . Dopo pochi minuti di raffreddamento , cristalli di ghiaccio avviamento devono essere formati all'interno del contenitore da " semina " il contenitore . Semina viene eseguita utilizzando uno strumento (per esempio pinze ) che sono state pre - raffreddato in azoto liquido a contatto con il contenitore e causare la formazione di cristalli di ghiaccio . Questo cristallo di avviamento avvierà la formazione di cristalli di ghiaccio controllata in un punto, a distanza di sicurezza dalle cellule . Una volta che semina è completa, il resto delle rampe di raffreddamento può procedere . Quando il contenitore raggiunge temperature comprese tra -30 e -85 C , il contenitore contenente le celle può essere immerso direttamente in azoto liquido per completare il raffreddamento a -196 C.
vetrificazione
procedure non -equilibrio refrigerazione ultra - rapidi

come vetrificazione utilizzano alte concentrazioni di crioprotettori accoppiato con un tasso di congelamento quasi istantaneo realizzato immergendo le celle direttamente in azoto liquido . Vetrificazione bypassa la fase di formazione di ghiaccio cristallino e si muove l' acqua direttamente in una fase simile al vetro . Vetrificazione raggiunge lo stesso endpoint come congelamento lento , ma ad un tasso di -3000C/min , rispetto a 10C/min o più . Per vetrificazione , le cellule sono in genere collocati sulla punta di una cannuccia e crioprotettore eccesso viene rimosso , lasciando appena sufficiente in modo che la cellula si aggrappa al contenitore dalla tensione superficiale , prima di immergersi in azoto liquido . Poiché congelamento è così rapida , la durata dell'esposizione al crioprotettori è molto meno , e concentrazioni molto più elevate di crioprotettori può essere tollerato dalla cellula . Il riscaldamento della cella per tornare al normale funzionamento metabolico deve essere anche incredibilmente rapida . Manipolazione dei campioni vetrificati è molto più esigente rispetto ai campioni lento congelati perché anche una breve esposizione a una temperatura superiore a quella dell'azoto liquido può avviare un processo di riscaldamento non pianificato e ricongelamento , che è dannosa per la cellula .