Quali metodi possono essere utilizzati per studiare le interazioni proteina-proteina?

Diversi metodi possono essere utilizzati per studiare le interazioni proteina-proteina. Ecco alcune tecniche comunemente utilizzate:

1. Co-immunoprecipitazione (Co-IP) :Il Co-IP è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare le interazioni proteina-proteina. Implica l'immunoprecipitazione di una proteina (proteina esca) da un lisato cellulare utilizzando un anticorpo specifico per la proteina esca. Il complesso proteico immunoprecipitato viene quindi analizzato per identificare altre proteine ​​(proteine ​​preda) che interagiscono con la proteina esca. Il Co-IP può essere seguito da vari metodi di analisi a valle, come Western blotting, spettrometria di massa o colorazione con immunofluorescenza.

2. Saggi pull-down :I test pull-down si basano sul principio della cromatografia di affinità. Una proteina esca viene immobilizzata su un supporto solido (come sfere magnetiche o resina di agarosio) attraverso legame covalente o fusione con un tag (ad esempio, GST o His-tag). Il lisato cellulare o la miscela proteica purificata viene quindi incubato con la proteina esca immobilizzata. Dopo il lavaggio per rimuovere le proteine ​​non legate, le proteine ​​interagenti (proteine ​​preda) vengono eluite e analizzate.

3. Trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) :FRET è una tecnica che misura il trasferimento di energia tra due fluorofori ravvicinati (donatore e accettore). Quando i fluorofori donatore e accettore sono molto vicini (tipicamente entro 10-100 Å), l'eccitazione del fluoroforo donatore determina l'emissione di luce da parte del fluoroforo accettore. Questo trasferimento di energia può essere quantificato e utilizzato per monitorare le interazioni proteina-proteina. FRET può essere implementato in vari modi, inclusa l'etichettatura delle proteine ​​con fluorofori specifici o l'utilizzo di proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate (ad esempio GFP e RFP).

4. Analisi delle interazioni biomolecolari (BIA) :La BIA, nota anche come risonanza plasmonica di superficie (SPR), è una tecnica senza etichetta che misura le variazioni dell'indice di rifrazione all'interfaccia di un vetrino e di un liquido che scorre. Una delle proteine ​​interagenti viene immobilizzata sulla superficie del vetro e l'altra proteina viene fatta passare sulla superficie. L'interazione tra le proteine ​​porta a cambiamenti nell'indice di rifrazione, che può essere rilevato e quantificato. La BIA può fornire informazioni sull'affinità di legame e sulla cinetica delle interazioni proteina-proteina.

5. Calorimetria di titolazione isotermica (ITC) :L'ITC è una tecnica che misura la variazione di calore associata all'interazione tra due molecole. Quando le proteine ​​interagiscono, il calore viene rilasciato (esotermico) o assorbito (endotermico). L'ITC può quantificare l'affinità di legame (Kd) e i parametri termodinamici, come la variazione di entalpia (ΔH) e la variazione di entropia (ΔS), delle interazioni proteina-proteina.

6. Array di interazione proteica :Gli array di interazioni proteiche implicano lo screening ad alto rendimento delle interazioni proteina-proteina in un formato microarray. Migliaia di proteine ​​o peptidi diversi vengono immobilizzati su una superficie solida e il legame di una specifica proteina di interesse viene rilevato utilizzando anticorpi marcati o altri metodi di rilevamento. Questa tecnica consente un'analisi rapida e su larga scala delle interazioni proteina-proteina.

7. Saggio del lievito due-ibrido (Y2H) :Il test Y2H è un metodo genetico utilizzato per identificare le interazioni proteina-proteina nelle cellule di lievito. Implica la fusione delle sequenze codificanti di due proteine ​​in due diversi domini di un fattore di trascrizione. Se le due proteine ​​interagiscono, il fattore di trascrizione viene ricostituito, portando all’espressione di un gene reporter. Le interazioni positive vengono identificate in base alla crescita delle cellule di lievito su terreni selettivi o test colorimetrici.

La scelta del metodo per studiare le interazioni proteina-proteina dipende dalle proteine ​​specifiche di interesse, dalla disponibilità di reagenti e apparecchiature e dal livello di informazione desiderato. Combinazioni di queste tecniche possono anche essere impiegate per ottenere informazioni complete sulle interazioni proteina-proteina.