QuikChange mutagenesi protocolli

QuikChange mutagenesi è il marchio di un kit utilizzato nella ricerca biotecnologica per indurre mutazioni genetiche o alterazioni del DNA . Agilent Technologies è la società dietro il prodotto, che è disponibile in due versioni , QuikChange II e QuikChange fulmini . Entrambi i kit contengono una soluzione tampone , l' enzima DNA polimerasi , reagenti di colore , sequenze di DNA o primer , e campioni di cellule . Mutant Strand Synthesis Reazione protocollo

Tecnici sintetizzano due oligonucleotidi o brevi sequenze di DNA contenente la mutazione desiderata . Poi si preparano reazione di controllo con le sequenze di DNA , soluzione dNTP mix e DNA polimerasi enzima , aggiungendo acqua distillata . Più tardi , si preparano una serie di reazioni di esempio utilizzando varie concentrazioni di DNA a doppia elica ( dsDNA ) , mantenendo primer o concentrazione oligonucleotidi costante , secondo le istruzioni del produttore . Continuano i campioni a 203 ° C per 30 secondi . Il campione contenente numero due del segmento di DNA viene testato anche in cicli di temperatura , una tecnica in cui le variazioni di temperatura durante brevi periodi di tempo . Infine , i campioni sono immessi sul ghiaccio per due minuti .
Dpn I Digestione del protocollo di amplificazione Products

Dpn I restriction enzyme taglia il DNA in siti specifici . Un micro - litro di questo enzima viene aggiunto direttamente a ciascuna reazione di amplificazione di sotto della sua copertura di olio minerale standard utilizzando una micropipetta o puntale aerosol resistente specializzato . Tuttavia , un olio minerale overlay è necessaria solo se il termociclatore , un apparecchio utilizzato per amplificare segmenti di DNA , non ha un gruppo hot- top . La reazione è miscelato delicatamente e poi messo in una micro - centrifuga per un minuto . Dopo di che , i campioni vengono incubate a 98,6 gradi C per un'ora .
Trasformazione di cellule XL1 -Blue Supercompetent protocollo

XL1 -Blue è una tetraciclina line- resistente cellulare che viene fornito con il kit QuikChange mutagenesi . Durante questo protocollo , i tecnici scongelare le cellule , che in precedenza erano tenuti a -112 gradi F , sul ghiaccio . Poi si aggiungono un micro - litro del DNA Dpn I- trattata , riscaldano a 107,6 ° C per 45 secondi e posizionare la reazione in ghiaccio per due minuti. Dopo questa procedura , i tecnici aggiungono una preparazione di NZY ( caseina idrolizzato ed estratto di lievito ) preriscaldata a 107,6 gradi F e incubare per un'ora . Il preparato viene poi messo su piastre di gel di agar e incubato a 98,6 gradi C per 16 ore .