Come scegliere la restrizione Enzymes

li enzimi di restrizione sono enzimi che tagliano il DNA a singolo e doppio filamento. Ogni enzima di restrizione ha una sequenza nucleotidica specifica chiamata un sito di restrizione che riconosce e taglia. Gli enzimi di restrizione vengono utilizzati per il sequenziamento del DNA l'analisi delle mutazioni e la clonazione e l'amplificazione del DNA. Gli scienziati usano gli enzimi di restrizione per inserire geni di interesse in vettori di espressione molecole di DNA che possono replicarsi separatamente dal DNA cromosomico. Il vettore contenente il gene di interesse può quindi essere introdotto in un ceppo batterico per l'espressione e la caratterizzazione delle proteine.

Identificare i siti degli enzimi di restrizione sul proprio vettore osservando una mappa di restrizione. La mappa di restrizione ti dirà quali enzimi taglieranno il tuo vettore e dove.

Scegli un enzima di restrizione che ha anche un sito presente sull'inserto del gene osservando la sequenza del inserire. Assicurati che il sito di restrizione sia posizionato sul tuo inserto al di fuori del gene di interesse in modo da non perdere nessuna parte del gene.

Assicurati che non ci siano duplicati del gene sito di restrizione ovunque nel tuo inserto o vettore di geni. Ciò causerà tagli multipli nel tuo DNA e ti fornirà dati fuorvianti.

Prova a scegliere gli enzimi di restrizione che tagliano con estremità appiccicose piuttosto che estremità smussate. Le estremità appiccicose si verificano quando l'enzima taglia il DNA a doppio filamento in modo sfalsato lasciando una singola sporgenza a trefoli che facilita l'attacco con un inserto tagliato nel modo opposto. Le estremità smussate si verificano quando il DNA a doppio filamento viene tagliato in modo uniforme e queste sono più difficili da collegare.

Scegli un enzima di restrizione diverso per entrambe le estremità dell'inserto per assicurarlo è inserito nel vettore con l'orientamento corretto e per garantire che il vettore non si riattacchi su sé stesso.

Prova a scegliere due enzimi di restrizione che funzionano bene nello stesso sistema tampone e temperatura . Se ciò non è possibile eseguire ogni digestione separatamente.

Suggerimento

Alcuni programmi Web sono stati sviluppati per identificare rapidamente i siti di restrizione su una sequenza di DNA. Uno di questi programmi è del New England BioLabs.

Cose necessarie

Sequenza del gene insert

Mappa di restrizione per il vettore di scelta

Elenco degli enzimi di restrizione e dei loro siti di taglio