Come fare anticorpo diluizioni per IHC

immunoistochimica ( IHC ) è una tecnica specialistica usata dagli scienziati per visualizzare le cellule all'interno dei tessuti che sono stati messi su un vetrino e colorate con un anticorpo appropriato che riconosce una proteina che è unico per la cellula o tessuto sotto indagine . Le diluizioni degli anticorpi ( titolazioni ) , deve essere effettuato utilizzando le condizioni sperimentali specificate nel proprio protocollo per l'utente , non quello del produttore del anticorpo , dal momento che i due non possono essere identici . Cose che ti serviranno
celle a macchiare
anticorpo
tampone di diluizione ( " diluente " )
Pipette e suggerimenti
tubo Microcentrifugare
Foglio di alluminio
marker di laboratorio e le etichette del tubo
Ice
casella di scorrimento protetto dalla luce

Mostra Altre istruzioni
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Controllare e preparare l'anticorpo . Verificare che l' anticorpo è stato sollevato nella host corretto , e reagisce con la versione esatta della proteina ( nota come isoforma , o variante di splicing ) che si sta testando . Usando una pipetta , prendere cura di una porzione 10 microlitri di questo ed etichetta come ' riserva personale ' .

Se solo piccole quantità di anticorpi sono disponibili , saltare questo passaggio .

Mantenere un archivio personale di anticorpo è pratica di routine in tutti i laboratori in quanto previene la contaminazione incrociata del titolo originale . Erogare questo in una provetta per microcentrifuga protetto dalla luce , o di un normale tubo da microcentrifuga che è avvolto in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce diretta .

Tenere questo tubo sul ghiaccio , preferibilmente in un Esky con un coperchio a tenuta d'aria , nuovamente per minimizzare luce , che può distruggere l'anticorpo . Prendere nota della concentrazione del titolo originale ( ad esempio, 100 unità per millilitro , 1 milligrammo per microlitro e così via) sul tubo , compreso il nome dell'anticorpo e che cosa, se del caso, il buffer viene diluito in ( es. siero , saline , o acqua, ecc ) .
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Preparare il tampone di diluizione , noto anche come diluente dell'anticorpo . Verificare che questo sia compatibile con l'anticorpo e la procedura immunoistochimica utilizzato , per esempio , non dovrebbe oscurare alcuna fluorescenza o inibire ad etichettatura anticorpo secondario successiva . Effettuare una diluizione immunoistochimica standard ( anche il buffer di blocco ) mescolando 1X tampone fosfato salino con 1 % Triton - X100 , siero di vitello fetale 10% e il 0,2% di sodio azide .
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Titolare l' anticorpo . Con la concentrazione proposta di anticorpo nel magazzino personale ( espresso in unità di concentrazione come microgrammi per microlitro ) , determinare il volume di anticorpo necessario per ottenere 10 microgrammi di anticorpo .

Impostare una serie di diluizioni pipettando un volume equivalente a 2 microgrammi di anticorpo (ad esempio X microlitri ) , in 100 microlitri di diluente e mescolare bene pipettando su e giù . Da questa diluizione di partenza , prendere le stesse microlitri X e aggiungere che ad un successivo 100 microlitri di diluente . Ripetere questa operazione fino 8-10 diluizioni (o una serie ) si compone .

L'ultimo tubo sarà quindi ha la concentrazione più bassa ed essere la " saturazione " concentrazione che genererà il massimo livello di segnale durante l'esperimento . Tuttavia, la concentrazione ideale sarà leggermente più concentrato di questo , quindi non troppo segnale viene prodotto , che può causare errori di fondo .

Etichettare i tubi correttamente con le nuove concentrazioni diluite .