Come misurare NADH

NAD e NADH sono entrambi i nucleotidi piridinici coinvolti nel metabolismo . NADH e NAD sono co- enzimi presenti nei mitocondri , le centrali elettriche della cella . Sia NAD e NADH sono coinvolti in reazioni cellulari come la respirazione e fotosintesi dove si generano energia e idrogeno . NAD e NADH combustibile reazioni biochimiche che richiedono un numero di enzimi per produrre ATP , la fonte principale di energia nelle cellule . Cose che ti serviranno
cellule o tessuti in fase di studio
NADH kit di analisi
PBS
ghiaccio secco
blocco Riscaldamento
96 pozzetti
Centrifuga
etichetta tubi
reader Piatto
Vortex
conosciuto concentrazione di NADH
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Tenore
1

lavare le cellule o tessuti in fase di studio con il fosfato freddo salina tamponata , PBS . Estrarre cellule o rompere il tessuto in tampone di estrazione collocando la miscela in ghiaccio secco per 20 minuti e poi a temperatura ambiente per 10 minuti . Ripeti .
2

Vortex per 10 secondi . Spin in una centrifuga per 5 minuti per far sedimentare cellulare o frammenti di tessuto . Rimuovere il surnatante , la fase liquida , e mettere il liquido in una provetta pulita .
3

Filtrare il surnatante attraverso un filtro speciale per rimuovere gli enzimi che sarà la ripartizione NADH .
4

Rimuovere 200 micro litri, posto in una provetta pulita e calore a 60 gradi Celsius in un blocco di riscaldamento per 30 minuti per denaturare NAD . Fresco e centrifugare e rimuovere fase liquida . Trasferire 50 microlitri in una piastra a 96 pozzetti ; ogni campione deve essere in due o tre esemplari . Per determinare NAD totale , NADt , non riscaldare .
5

Preparare e aggiungere mix in bicicletta alla piastra a 96 pozzetti . Miscelare e incubare per 5 minuti. Aggiungere 10 microlitri di sviluppatore e lasciare incubare a temperatura ambiente per un massimo di 4 ore. Aggiungere la soluzione di stop . Leggi cambiamento di colore su un lettore di piastre o fluorimetro a seconda del kit.
Curva standard e di calcolo
6

Preparare una curva standard prendendo una concentrazione nota di NADH e diluizione in tampone di estrazione . Diluire in diverse concentrazioni , garantendo il volume finale rimane lo stesso come campioni di prova . Piastra sulla stessa piastra a 96 pozzetti come campioni di prova . Leggere la densità ottica .
7

Tracciare il grafico curva standard con la concentrazione sull'asse X e la densità ottica sull'asse Y . Prendete una media di ciascun campione e leggere la concentrazione dal grafico curva standard .
8

Calcolare il rapporto NAD /NADH sottraendo NAD totale , NADt , dal NADH e poi dividendo per NADH .