Qual è elettroforesi su gel

? Gel elettroforesi è un metodo per separare , identificare e caratterizzare miscele di proteine ​​o acidi nucleici . Campioni denaturati migrano dopo l'applicazione di energia elettrica in un sottile , gel bagnato in genere a base di poliacrilammide o agarosio . I campioni separati sono macchiati in modo che possano essere visti . Elettroforesi su gel è usato in proteine ​​e la ricerca di acido nucleico e negli ospedali per identificare proteine ​​insolite o modelli di DNA per diagnosticare malattie , difetti genetici e relazioni genetiche . Preparazione del campione

Quando un detergente come dodecylsulfonate sodio ( SDS ) è aggiunto ad una proteina o acido nucleico , il detersivo associare ed estrarre ( denaturato) proteine ​​e acidi nucleici . Denaturazione delle proteine ​​rende più facile determinare il loro peso molecolare in elettroforesi . La quantità di campione richiesto è tipicamente da 100 a 500 nanogrammi per banda campione di proteine ​​e 5 a 100 ng per banda di acidi nucleici in un volume totale di circa da 25 a 40 microlitri .
Gel

gel , tipicamente fatto di poliacrilammide o agarosio , possono essere preparati o acquistati per separare queste proteine ​​. Il gel è molto simile a gelatina. Esso è principalmente acqua , ma è abbastanza solido per la gestione . I gel contengono tampone per controllare il pH . Il gel è molto sottile (da 1 a 2 mm) e rettangolari . Un lato si presenta come un pettine con un sacco di denti mancanti . Le lacune sono chiamati pozzi .
Caricamento campione

si mette il gel in una camera con buffer e le proteine ​​denaturate sono aggiunti ai pozzetti . Campioni di pesi molecolari noti vengono aggiunti ai pozzetti esterni . I gel sono realizzati con diverse quantità di poliacrilammide . Una forza gelificante bassa (4 per cento ) è migliore per separare molecole ad alto peso molecolare , mentre una forza gelificante superiore ( 12 percento ) viene utilizzata per molecole di peso molecolare più elevato . Un gel gradiente varia in forza del gel e può separare una vasta gamma di proteine ​​con la perdita di alcuni risoluzione.
Elettromigrazione

Con l'applicazione di una elevata tensione elettrica , le proteine ​​denaturate si muovono verso il fondo del pozzo . Più alto è il peso della proteina , più lenta si muove . Quando l' energia elettrica è spento , le proteine ​​si arrestano. Uno rimuove il gel dalla camera e rocce in un piatto con la tintura . Coloranti organici come Coomassie blu o coloranti metallici sono utilizzati per le proteine ​​macchia mentre coloranti fluorescenti come il bromuro di etidio sono utilizzati per acidi nucleici .
Analisi dei Risultati

Con l' rimozione di eccesso di colorante , si può vedere che le miscele separano in bande che sembrano scale . La posizione delle bande è confrontata con la distanza percorsa dalle norme per determinare il peso molecolare del campione in ciascuna banda . Il gel può essere disidratato ed essiccato con alcool in modo che possa essere salvato . L'intensità del colore della banda , allora può essere misurato per determinare la concentrazione della proteina in ciascuna banda .
Protocol Development

protocolli standard sono disponibili per lavorare con ben - proteine ​​note . Se un ricercatore sta lavorando con un campione sconosciuto , la forza del gel , tipo di buffer , buffer di pH, tensione , tempo di esecuzione , e le macchie possono tutti bisogno di essere ottimizzato per ottenere la migliore separazione e di segnale.
protocolli