Istruzioni Western Blot

analisi Western Blot è una tecnica ben nota per l'identificazione di proteine ​​specifiche isolate dal tessuto . Le diverse proteine ​​vengono prima separate da carica e peso su gel di SDS - poliacrilammide e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa . Dopo il trasferimento , anticorpi marcati legano specificamente con la proteina desiderata e vengono fotografati con pellicola a raggi X o visualizzate tramite colorazione specifica - proteina . Il risultato finale mostra bande scure indicano la presenza della proteina identificata . Questo articolo si concentra sulla metodologia di base per l'esecuzione di analisi Western Blot in un laboratorio qualificato per la ricerca di proteine ​​complesse . Cose che ti serviranno
gel di SDS - poliacrilammide ( SDS - PAGE) con le proteine ​​separate
nitrocellulosa membrana
acqua distillata
Transfer tampone ( Tris 30 g , 144 g di glicina e 200 ml di metanolo in 1 l acqua)
carta da filtro , Whatman 3 millimetri
spugna Laboratorio
Western blot camera di trasferimento
alimentatore da laboratorio
Laboratorio frigorifero
Laboratorio agitatore
Tris tamponata soluzione salina ( TBS ) ( 24.2 g Tris Base , 80 g di NaCl in 1 l di acqua )
Blocco soluzione ( 5 per cento di latte scremato in polvere in TBS )
soluzione di anticorpo primario
soluzione di anticorpo coniugato marcato
alcalina soluzione di substrato per la fosfatasi con nitro blu macchia tetrazolium
tampone fosfato ( PBS )
box Gel - imager

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Trasferimento proteine ​​di membrana nitrocellulosa
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Preparare la membrana di nitrocellulosa . La membrana deve essere messo a bagno in acqua distillata per due minuti , poi collocati nel buffer di trasferimento e consentito in ammollo per cinque minuti .
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Assemblare un panino trasferimento costituiti da carta spugna /filtro /SDS PAGE /carta membrana di nitrocellulosa /filter /spugna. Il panino è allineato in modo che la membrana si trova più vicino al anodo e il gel più vicino al catodo all'interno della camera di trasferimento .
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Aggiungere buffer di trasferimento nella camera in modo sandwich è sommerso . Posizionare la camera all'interno del frigorifero del laboratorio . Trasferimento di proteine ​​dal gel alla membrana deve essere eseguita a 4 gradi Celsius .
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Impostare l'alimentazione per trasferire le proteine ​​dal gel sulla membrana . La direzione di trasferimento è verso l'anodo indicato dal cavo rosso . Proteine ​​più grandi si muovono più rapidamente in risposta ad una corrente elettrica e si sposteranno prima . L'alimentatore controlla la velocità di trasferimento . Impostare la potenza a 30 V e 40 mA per un trasferimento durante la notte .
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Smontare l'alimentazione dopo che il trasferimento è stato completato. Non fare contatto con il buffer di trasferimento o rimuovere il panino mentre è collegato all'alimentazione.
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Rimuovere la membrana dal panino e incubare per due ore in una soluzione bloccante . Proteine ​​nella soluzione bloccante assorbiranno nella membrana dove non sono presenti proteine ​​. Si eviterà eventuali anticorpi di legarsi alla membrana dove la proteina desiderata non è presente .
Legatura l' anticorpo
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incubare la membrana di nitrocellulosa con la soluzione di anticorpo primario utilizzando un agitatore . La membrana deve essere completamente immerso nella soluzione per almeno un'ora . E ' accettabile per incubare una notte .
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Lavare accuratamente la membrana per rimuovere l'anticorpo non legato . Quattro lavaggi separati di 10 minuti con TBS sono in genere sufficienti per rimuovere l'anticorpo in eccesso.
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Incubare la membrana in una soluzione di anticorpo coniugato marcato con l'agitatore . La membrana deve essere incubate per almeno un'ora. Il coniugato anticorpo marcato è destinato a fosfatasi alcalina . E 'il mix enzima -anticorpo che riconoscere e legarsi al primo anticorpo .
Rivelazione della proteina
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Sciacquare la membrana per 10 minuti in PBS quattro volte . Questo rimuoverà il resto del coniugato anticorpo marcato .
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Incubare la membrana in una soluzione substrato per la fosfatasi alcalina fino a comparsa modelli band. Il colorante nella soluzione substrato si lega alla proteina - antigene - anticorpo nella membrana e formare una banda di colore scuro . Il processo può essere immediata o richiedere fino a 30 minuti prima che vengano rispettate le fasce .
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Avvolgere la membrana completamente nel cellophane e posizionarlo direttamente sul gel - imager per visualizzare i risultati . Il gel - imager è in grado di fotografare i risultati visualizzati sulla membrana Western Blot .