Come misurare la vitalità cellulare

Nella maggior parte degli esperimenti biologici che coinvolgono coltura cellulare , un passo fondamentale include sapere che le cellule sono vive e che sono morti nel campione . Esclusione del colorante è il metodo più popolare per misurare la vitalità cellulare . Esclusione del colorante si basa sulla teoria che contengono cellule vive membrane intatte e cellule morte non , così le cellule morte assorbono il colorante nel citoplasma . Ci sono diversi coloranti e protocolli ei metodi scelti dovrebbero essere basati sui costi , la sensibilità , la facilità e la lunghezza del procedimento . Trypan blu è un colorante comunemente usato per misurare la vitalità cellulare perché la procedura può essere realizzata in cinque a 10 minuti e costa solo la quantità di reagente colorante . Cose che ti serviranno
0,4% trypan blu reagente
emocitometro
copertura antiscivolo
micropipetta consigli di pipette
tampone fosfato ( PBS )
Microscopio ottico

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ottenere un pellet di cellule che si sta misurando .
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Risospendere il pellet di cellule in PBS per ottenere circa 5 x 105 cellule /ml . PBS è usato perché misure di vitalità sono più precisi quando le cellule sono in un ambiente privo di siero; proteine ​​del siero possono anche macchiare e dare risultati fuorvianti .
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Aggiungi parti uguali di sospensione cellulare in PBS a parti uguali del 0,4 % trypan colorante blu per ottenere un 1-2 diluizione ( esempio : . 100 ul di cellule a 100 ul di trypan blu ) e mescolare pipettando su e giù
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Incubare miscela per meno di tre minuti a temperatura ambiente . Se le cellule vengono conteggiate dopo circa cinque minuti , la redditività sarà inesatto a causa di morte cellulare .
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Con la polizza di copertura già in atto, riempire ogni lato di un contatore emocitometro con la sospensione cellulare . In genere , ogni parte prenderà 10-20 ul .
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Posizionare il emocitometro sul palco di un microscopio ottico e concentrarsi sulle celle .
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Ogni lato del il emocitometro contiene più piazze . Contare il numero totale di cellule in un quadrato del emocitometro . Poi contare il numero di non vitali ( blu) e ( chiaramente ), le cellule vitali separatamente , nella stessa piazza .
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Calcolare la percentuale di cellule vitali in piazza dividendo il numero di cellule vitali per il numero di cellule totali e moltiplicando per 100 . Fate questo per più quadrati sul emocitometro per ottenere una misura media della redditività.