Come condurre una FRET Assay

trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza ( FRET ) è una tecnica di dosaggio utilizzato per misurare la presenza e la quantità di legame tra due proteine ​​reporter linked . Questo test è comunemente utilizzato per analizzare le proteine ​​potenzialmente vincolanti in vari tipi di cellule , e per misurare l'efficacia di coniugazione tipo enzimi . L'apparecchiatura di rilevamento necessaria dipende in gran parte dai tipi di molecole reporter in uso , se molte volte un semplice lettore di piastre a 96 pozzetti possono essere usati. Cose che ti serviranno
Protein-of-interest/Reporter molecola costruisce per ogni proteina in prova
blocco piastra a 96 pozzetti
lettore di piastre a 96 pozzetti
tampone di reazione ( generalmente Tris - o - fosfato -based - salina tamponata )
Coniugazione enzima ( se necessario)
Mostra Altre istruzioni
configurazione e lettura
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generare o preparare costrutti di fusione di ogni proteina di interesse , ciascuno dei quali è collegato ad una molecola di fluorescenza di trasmissione , come la proteina fluorescente verde ( GFP ) , rodamina o boro - dipyrromethene ( BODIPY ) .
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Determinare assorbanza e di emissione lunghezze d'onda di ciascun componente fluorescente e di il saggio generale . ( Ad esempio , se il saggio misura GFP -> rodamina trasferimento di energia di fluorescenza , la lunghezza d'onda di ingresso assorbanza è quello di assorbanza di GFP ( 488 nm ) , e la lunghezza d'onda di emissione di rilevamento è che per rodamina ( 595 nm ) )
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Crea tampone di reazione appropriata per l'esperimento , a seconda delle proteine ​​delle proprietà biochimiche di interesse . Un tampone TRIS - è spesso usato , compresi cloruro di calcio e 0,05 per cento Tween - 20 . Concentrazioni e componenti specifici possono essere determinati dalla ricerca di voci di diario che descrivono le reazioni e condizioni simili .
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Mescolare le due proteine ​​reporter coniugato di interesse a varie concentrazioni nel buffer di reazione , e un'aliquota 50-200 ul per pozzetto . Aggiungere un enzima di coniugazione ( per esempio , sortase ) per ciascun campione se del caso . Se si esegue un test end-point , permettere di incubazione a temperatura ambiente ( o temperatura ottimale di enzima ) per un determinato periodo di tempo , quindi leggere il lettore di piastre a 96 pozzetti . Se si esegue un test cinetica , procedere direttamente alla lettura ( vedi sotto) . Piastra
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Inserisci campione nel lettore di piastra a 96 pozzetti . Creare una nuova pagina esperimento e accedere al menu delle impostazioni . Ingresso l'assorbanza corretta ( eccitazione) e lunghezze d'onda , quindi selezionare i pozzetti da leggere .

Se si esegue un esperimento di cinetica , impostare l'ora - corso dell'esperimento e il periodo di intervallo di valori ( ad esempio una volta ogni 10 minuti) .

inizierà la lettura del campione .

Analizzare i dati utilizzando la funzione grafica di Microsoft Excel ( o altro programma di grafica come GraphPad ) .