Come eseguire un saggio ELISA

ELISA , o analisi enzima-collegata immunoabsorbent , è una tecnica di laboratorio biochimico fatto di rilevare un antigene ( ad esempio una proteina ) o anticorpo in un campione sperimentale . Il saggio sfrutta obbligatorio anticorpo - antigene e può essere utilizzato per saggiare altra cellula e meccanismi molecolari vincolanti pure. In un saggio ELISA a base di proteine ​​, una " catturare " anticorpi o proteine ​​sono stabilite in un piatto di dosaggio e ha permesso di aderire al piatto , dopo di che la "sonda" agente ( ad esempio una proteina di interesse ) è definito e incubato con l' agente di cattura . Dopo diversi lavaggi , una " rilevazione " anticorpo viene aggiunta al fine di visualizzare la presenza o l'assenza di anticorpi antigene o proteina - proteina legante . Cose che ti serviranno
piatto Assay ( per esempio, il blocco a 96 pozzetti )
anticorpo di cattura ( diluito a 5 ug /ml nel 50 NaHCO2 mM , pH 9,6 )
Probe anticorpi /proteine ​​( diluito a vari concentrazioni )
anticorpo di rilevazione ( per esempio , perossidasi di rafano - anticorpi accoppiati )
tampone PT ( 1x PBS , 0,05 per cento Tween - 20 )
tampone di bloccaggio ( 1x PBS con 5 mg /ml BSA , o 5 per cento latte scremato in 1x PBS )
reagente di rilevamento ( es. miscela reagente TMB )
meccanica laboratorio shaker
stanza fredda o frigorifero
pipetter e consigli

Mostra Altre istruzioni

1

Diluire anticorpo di cattura a 5 ug /ml nel 50 NaHCO2 mM (pH 9.6) . Aggiungere 50 uL a ciascun pozzetto del piatto del campione utilizzato per il test . Coprire con plastica o alluminio e incubare una notte a 4 ° C su un agitatore .
2

Autocarro fuori anticorpo di cattura e lavare due volte con tampone di 200 uL PT . Aggiungere 200 ul di tampone bloccante per pozzetto ( latte scremato PB o 5 per cento ) . Incubare ovunque da due ore a tutta la notte agitando a 4 gradi C.
3

Dump fuori tampone di bloccaggio e lavare 4 volte con 200 tampone uL PT . Aggiungi "sonda" campioni di proteine ​​in varie concentrazioni in PB o il 5 per cento del latte scremato , l'aggiunta di 100 ul per pozzetto . Incubare uno ora agitazione a 4 ° C. Dump soluzioni sonda e lavare sei volte con buffer di 200 uL PT .
4

Aggiungi anticorpo (anticorpo HRP - coniugato ) diluito 1:4000 in tampone PB o latte scremato 5 per cento ( uno dei due contenente lo 0,05 per cento Tween - 20 ) , aggiungendo 50 ul per pozzetto . Incubare per 30 minuti a un'ora stringono a 4 gradi C.
5

dump soluzione anticorpo di rilevazione e lavare 6 volte con tampone di 200 uL PT per bene , seguito da lavare due volte con 200 uL di 1x PBS ( soluzione salina tamponata con fosfato ) . Dump su PBS e aggiungere 100 ul di reagente di rilevamento per bene ( per HRP , utilizzare appena misto reagente TMB miscelando substrato TMB e perossido a 1:1) . Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente , agitando di tanto in tanto .

Quando si utilizzano TMB e HRP : Infine , aggiungere 100 ul di 1M H3PO4 (acido fosforico ) per bene , al fine di placare la reazione TBM

Leggi piatto con lettore l'analisi del campione , come ad esempio un lettore di piastra a 96 pozzetti . . (Per HRP e TMB , utilizzare il modello " ELISA End -Point Assay" disponibile sulla maggior parte dei lettori . )