Come risolvere un Three Fragment legatura

legatura è un metodo utilizzato nella ricerca biologica per unire filoni separati di DNA . Il processo è stato semplificato utilizzando kit di ligazione disponibili in commercio . Una procedura di legatura è generalmente seguita da trasformazione , un processo inserendo il DNA uniti in un recipiente vettore batterico , clonare e amplificare il DNA . A causa della complessità del metodo , i risultati spesso non corrispondono con il prodotto desiderato e richiedono la risoluzione dei problemi . Questo è più predominante nel tentativo di unire più frammenti , come in legatura tripla. Cose che ti serviranno
kit legatura
legatura protocollo
agarosio gel
50 X TBA tampone ( 242 g base di Tris , 57,1 ml di acido acetico glaciale , 100 ml di 0,5 M EDTA diluito a 1 litro con acqua )
acqua deionizzata
DNA Purification Kit

Mostra Altre istruzioni
Risolvere trasformazione
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Formulare un elenco di passaggi coinvolti nella legatura e trasformazione . Risoluzione dei problemi di qualsiasi protocollo scientifici generalmente inizia con la fase finale , a ritroso .
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Confronta prodotto DNA purificato dal campione di DNA di controllo , fornito con il kit . Una volta che il DNA è stato trasformato e clonato nei batteri , esso può essere isolato , purificato e controllato mediante elettroforesi su gel di agarosio . I risultati per elettroforesi sarebbero indicano se la trasformazione ha avuto successo .
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determinare la crescita batterica durante la clonazione . La maggior parte dei vettori batterici sono costruiti in modo che solo quelli con un inserto di DNA - crescerà in un terreno contenente ampicillina , o altro antibiotico . Scarsa crescita potuto stabilire che il campione di DNA non è stato inserito correttamente nel vettore .
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Verificare che il campione di DNA ligato è stato purificato , prima della trasformazione. Sali tampone ed enzimi legatura potrebbero inibire la trasformazione del DNA inserito . E 'anche importante accertarsi che l'enzima di ligazione è stata inattivata dal calore , dopo il completamento della procedura di legatura . Ligasi attivo può potenzialmente interferire con la trasformazione .
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Controllare la data in magazzino batterico utilizzato per la trasformazione. Cellule batteriche vecchi perdono efficienza nel tempo . Infine le cellule batteriche sono incapaci di trasformazione e clonazione qualità . Una volta che il processo di trasformazione è stata diagnosticata , si può iniziare l'analisi della procedura di legatura .
Risoluzione dei problemi legatura
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Confermare la purezza del vostro campione di DNA , prima della legatura . Contaminanti sale nel campione di DNA potrebbe tradursi in scarsa legatura . Il campione di DNA deve essere purificato e privo di sali ed enzimi , prima di essere utilizzato in legatura .
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Verificare se le estremità dei filamenti di DNA da legatura sono smussati o appiccicose . La legatura viene utilizzato per collegare moduli distinti con le estremità smussate o estremità appiccicose , dopo digestione con enzimi di restrizione designati . DNA ligasi T4 è l'enzima di scelta per DNA estremità smussata - ma funziona anche per il DNA con estremità appiccicose . Altri ligasi di DNA possono funzionare solo per il DNA , a seguito di una restrizione digerire per creare estremità appiccicose . E ' importante usare la giusta ligasi del DNA testato .
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partner di concentrazione di campioni di DNA prima della legatura . Utilizzando DNA con alta concentrazione provoca spesso DNA a diventare lineare . Le istruzioni del kit forniranno informazioni sulla corretta quantità di DNA da utilizzare in una reazione di legatura .
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Sostituire ligasi enzima con un nuovo lotto . Gli enzimi sono particolarmente sensibili a temperatura ambiente e continui cicli di congelamento -scongelamento . La ligasi potrebbe essere danneggiato a seguito di un numero di utilizzi , semplicemente mediante congelamento e scongelamento troppe volte . Alcuni kit raccomandano che ligasi essere frazionato in porzioni più piccole durante l'utilizzo iniziale , per ridurre il numero di volte che è nuovamente congelato .
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Controllare il kit legatura . Spesso il problema con legatura sta usando un kit che è scaduto o è stato contaminato con altri DNA e sali .