La risoluzione di gel elettroforesi

elettroforesi su gel di poliacrilammide , o PAGE , è una tecnica comunemente usata per la separazione di molecole organiche in un campione biologico . Molecole con minori dimensioni e peso migrano più velocemente su un gel di poliacrilammide quando viene applicata una corrente elettrica . Bande distinte chiari sono generalmente osservati dopo il gel completato viene incubata in una particolare colorazione . Si tratta di un metodo relativamente semplice . Tuttavia , meno di fasce o bande che striscio o impuri potrebbe indicare un problema in una o più fasi del metodo . Si consiglia di seguire le linee guida di base per risolvere un metodo gel elettroforesi quando i risultati non sono come previsto. Cose che ti serviranno
bis grado di qualità : acrilammide o lastre prefabbricate
Due lastre di vetro
acrilammide : Bis
TBE Buffer ( TRIS , acido borico , EDTA )
Alimentazione
superiore camera di transito
Bassa camera polmone
Proteina del campione di DNA
TEMED
ammonio persolfato
Gel macchia

Mostra Altre istruzioni
1

Una Inizia con la fase finale di elettroforesi su gel prima e lavorare a ritroso . Per gel elettroforesi , il passo finale è la procedura di colorazione utilizzata per osservare bande di esempio . Pochi problemi dovrebbero effettivamente verificarsi durante la procedura di colorazione . Tuttavia , macchie polvere devono essere ben sciolti nel tampone appropriato prima di essere utilizzati per colorare un gel . Accertare la corretta concentrazione di colorante è stato utilizzato .
2

Controllare l'alimentazione . L'assenza di bande potrebbe indicare l'impostazione corrente o tensione era troppo alta e campioni di prova migrato il gel . Alti impostazioni possono anche causare componenti del campione per migrano attraverso il gel troppo velocemente , causando scarsa risoluzione e la band che appaiono sporche . I campioni possono non migrano attraverso il gel se l'impostazione di alimentazione è bassa . I campioni possono anche deriva dal pozzo dove sono stati caricati e non migrano attraverso il gel .
3

Controllare l' acrilamide liquido usato per lanciare il gel di poliacrilammide . In genere , la percentuale di acrilamide utilizzato per lanciare un range di gel di poliacrilammide dal 5 al 15 per cento . Campioni costituiti da molecole più grandi vengono caricati su un gel 5 per cento a causa grandi frammenti muovono più lentamente su gel di acrilammide con una percentuale più elevata . Piccole molecole vengono caricati su un gel per cento più alto , perché una bassa concentrazione di gel non sarebbe in grado di risolvere i campioni più piccoli .
4

Controllare i reagenti utilizzati per polimerizzare l' acrilamide . Un gel di poliacrilammide è formata mediante polimerizzazione di una miscela liquida costituita da bisacrylamide e acrilammide . Ammonio persolfato e TEMED vengono aggiunti al acrilammide per catalizzare la formazione di gel . Tipicamente , l' acrilamide dovrebbe mostrare segni di polimerizzazione ( formazione di gel ) 15 minuti dopo sono stati aggiunti persolfato di ammonio e TEMED . Polimerizzazione che avviene troppo rapidamente è il risultato di elevate quantità di persolfato di ammonio . Troppo poco persolfato di ammonio può causare polimerizzazione incompleta o irregolare .
5

Confermare la quantità dei campioni caricati . Alte concentrazioni di campioni possono muoversi lentamente attraverso il gel e ridurre la risoluzione band. Una concentrazione del campione che è bassa non può essere osservato dopo il gel è stato colorato . Queste macchie sono limitazioni alla quantità minima di campione che può essere immaginata come risultato di sensibilità macchia .
6

qualità Conferma dei campioni caricati . Sali e altri contaminanti presenti in un campione possono influenzare il movimento del campione lungo il gel . L'elettroforesi è il risultato della corrente elettrica che attraversa un gel che contiene un buffer conduttive ; elevata concentrazione salina nel campione possono influenzare il movimento di questa corrente attraverso il gel . Il tuo isolamento di un campione dovrebbe incorporare un kit di purificazione che produrrà un campione relativamente puro .
7

letteratura Recensione o il protocollo scritto per determinare se il buon PAGE è stato utilizzato per condurre l'esperimento . La percentuale di acrilammide in PAGE è specifico per la dimensione del campione da testare . La letteratura potrebbe anche fornire informazioni specifiche rispetto alla messa a punto di alimentazione e il tasso di migrazione di campionamento .