T -Cell Culture protocolli

T-cellule , che appartengono ad una famiglia di cellule immunitarie chiamate linfociti , sono generati nel corso di una risposta immunitaria adattativa . Cellule T originano da cellule staminali del midollo osseo e maturano nel timo . Ci sono diversi tipi di cellule T , ciascuno con una funzione diversa . Cellule T si distinguono tra loro dal recettore dell'antigene delle cellule T divisoria . Un sottoinsieme di cellule T CD4 porta il marcatore e aiuta a indurre una risposta immunitaria . Fonti di cellule T

cellule T possono essere ottenute da varie fonti , tra cui la milza , linfonodi e del timo , ma sangue periferico è la fonte più facilmente disponibile di cellule T a fini di cultura . I campioni di sangue sono accuratamente selezionati per le infezioni e altri contaminanti e maneggiati con cura sotto un armadio di sicurezza . T - cellule sono coltivate per diversi motivi , tra cui misure della tossicità e per studiare le risposte immunologiche vaccino .
Isolamento

cellule T sono spesso separati da campioni di sangue intero dalla densità - gradiente separazione , come le cellule T sono meno densi globuli rossi come eritrociti e quindi estratti per centrifugazione . Una soluzione di sale neutro appropriato viene aggiunta al campione di sangue , seguita da una soluzione isopaque Ficoll . Ficoll isopaque ha una densità maggiore di cellule T ma meno di eritrociti e durante la centrifugazione forma uno strato intermedio tra i due cellule , consentendo cellule T per essere rimosso dalla parte superiore . Le cellule T sono ulteriormente centrifugato , il surnatante viene rimosso , e una piccola aliquota viene contato per determinare la vitalità cellulare . Le cellule sono sia utilizzati direttamente per esperimenti o crioconservati per un uso futuro . Reagenti
Crioconservazione

di crioconservazione sono preparati in anticipo per evitare la degradazione delle cellule T in camera temperatura . Se non è possibile , le cellule sono tenuti in ghiaccio o in frigorifero . Reagenti consistono di cellule terreni di coltura e 10-13 percento albumina sierica umana ( HSA ) proteine ​​, nonché mezzi di coltura cellulare e il 10 per cento dimetilsolfossido ( DMSO ) . DMSO minimizza disidratazione , variazioni di pH, e le variazioni di concentrazione di elettroliti associato con il congelamento . T - cellule sono risospese in terreno di coltura cellulare contenente il reagente e HSA in un criotubo . Il DMSO contenente il reagente viene aggiunta lentamente alle cellule e agitato lentamente . Le cellule sono poi trasferiti in un recipiente contenente congelamento isopropanolo per garantire una diminuzione graduale della temperatura e memorizzati .
Scongelamento

Quando le cellule T vengono scongelati , un criotubo viene rimosso dal magazzino e incubate a 37 gradi Celsius . Successivamente , il mezzo scongelamento appropriato viene aggiunta lentamente alle cellule fino a raggiungere il doppio del volume , trasferito in un tubo separato , e centrifugato . Benzonasi volte è aggiunto al mezzo di scongelamento per impedire l' aggregazione delle T - cellule morte . Il pellet viene centrifugato risposto in terreni di coltura delle cellule e la vitalità cellulare viene valutata . Le cellule T sono quindi pronti per l'uso per rispettivi esperimenti.