Cellula superficiale Biotinilazione Protocol

Biotinilazione utilizza la capacità della vitamina solubile biotina per legarsi a proteine ​​cellulari. Biotina si lega alla proteina strepavidin ed è, pertanto, utile nella biologia cellulare per visualizzarne proteine ​​cellulari. Biotinylation permette l'etichettatura sicuro delle proteine ​​rispetto a tecniche come radioattività e non influenza la normale funzione della cellula. Esso consente ai ricercatori di studiare le proteine ​​cellulari, quali i recettori, e che consente una maggiore comprensione delle malattie e dei processi di malattia. Etichettatura cellule sospese
Lavare le cellule

fosfato ghiacciata soluzione salina tamponata (PBS) per rimuovere i contaminanti. Tamponi contenenti tris e glicina si sfideranno con biotinilazione e dovrebbero essere evitati. Per evitare biotinylating proteine ​​interne, l'etichettatura può essere eseguita a 4 gradi Celsius o in presenza di azide. Risospendere le cellule in PBS e la biotina solubile, solfo-NHS-LC-biotina.
Etichettatura cellule aderenti

Lavare le cellule in PBS e incubare con un prodotto come solfo -NHS-LC-biotina. Le cellule sono poi raschiate in un piatto e lisate in un buffer contenente il detergente Triton X-100 e preparate per la visualizzazione.
Preparazione cellule marcate

seguito incubazione, le cellule vengono centrifugate in un pellet e lavate in PBS. Le cellule sono risospese in PBS e purificati con il gel IgG Sepharose. Le proteine ​​viene diluito in tampone di caricamento e riscaldato a 100 gradi Celsius.
Visualizzare cellule
proteine ​​diluito

può essere visualizzato utilizzando sodio dodecil solfato di elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS- PAGE) seguita tamponando con la proteina enzimatica e mescolare, streptavidina-rafano perossido. Macchie sono visualizzati con una reazione chimica --- chemiluminescenza --- che emette luce. Specificità del biotinilazione può essere confermata con anticorpi per la proteina in esame.