Come fare diluizioni degli anticorpi per IHC

immunoistochimica (IHC) è una tecnica specialistica usata dagli scienziati per visualizzare le cellule all'interno dei tessuti che sono stati messi su un vetrino e colorate con un anticorpo appropriato che riconosce una proteina che è unico per la cella o tessuto sotto inchiesta. Diluizioni anticorpali (titolazioni), devono essere effettuate utilizzando le condizioni sperimentali specificate nel proprio protocollo dell'utente, non quella del produttore del anticorpo, poiché i due non potrebbero essere identici. Cose che ti serviranno
Cellule di macchiare
Antibody
Tampone di diluizione ("diluente") per Pipette e suggerimenti
microcentrifuga tubo
Foglio di alluminio
marcatori di laboratorio e le etichette tubo
Ice
luce protetta scivolo box
Mostra più istruzioni
1

controllare e preparare l'anticorpo. Verificare che l'anticorpo è stato sollevato nella host corretto, e reagisce con la versione esatta della proteina (nota come isoforma, o variante di giunzione), che si sta testando. Usando una pipetta, attentamente prendere una porzione 10 microlitri di questo e di etichetta come 'riserva personale'.

Se solo piccolissime quantità di anticorpi sono disponibili, ignorare questo passaggio.

Mantenere una riserva personale di anticorpo è pratica di routine in tutti i laboratori in quanto previene la contaminazione incrociata del titolo originale. Erogare questo in una provetta per microcentrifuga protetto dalla luce, o un normale tubo da microcentrifuga che è avvolto in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce diretta.

Tenere questo provetta in ghiaccio, preferibilmente in un Esky con un coperchio a tenuta d'aria, nuovamente per minimizzare la luce, che può distruggere l'anticorpo. Prendere nota della concentrazione del titolo originale (ad esempio, 100 unità per millilitro, 1 milligrammo per microlitro e così via) sul tubo, compreso il nome dell'anticorpo e che cosa, all'occorrenza, il tampone viene diluita in (ad esempio siero, saline, o acqua ecc).
2

Preparare il tampone di diluizione, noto anche come il diluente dell'anticorpo. Controllare che questo sia compatibile con l'anticorpo e la procedura di immunoistochimica utilizzato, per esempio, non dovrebbe oscurare alcuna fluorescenza o inibire ad un'ulteriore marcatura anticorpo secondario. Fai una diluizione immunoistochimica standard (anche il tampone di bloccaggio) miscelando fosfato 1X soluzione salina tamponata con 1% Triton-X100, siero fetale bovino 10% e il 0,2% di sodio azide.
3

Titolare del anticorpo. Con la concentrazione data di anticorpi nella riserva personale (espresso in unità di concentrazione, come microgrammi per microlitro), determinare il volume di anticorpo necessario per ottenere 10 microgrammi di anticorpo.

Impostare una serie di diluizioni: prelevare un volume equivalente a 2 microgrammi di anticorpo (es. X microlitri), in 100 microlitri di diluente e mescolare bene pipettando su e giù. Da questa diluizione di partenza, prendere le stesse microlitri X e aggiungere che ad un successivo 100 microlitri di diluente. Ripetere questa operazione fino 8-10 diluizioni (o una serie) si compone.

L'ultimo tubo sarà quindi hanno la più bassa concentrazione ed essere la concentrazione di "saturazione" che genererà il massimo livello di segnale durante l'esperimento . Tuttavia, la concentrazione ideale sarà leggermente più concentrata di questo, in modo che non troppo segnale viene prodotto, che può causare errori di fondo.

Etichetta i tubi correttamente con le nuove concentrazioni diluite.