Clonazione molecolare Protocolli

protocolli di clonazione molecolare comprendono le procedure utilizzate per la definizione, isolando e replicare una sequenza di DNA. Restrizione tradizionale e protocolli di clonazione legatura avviare la frammentazione del DNA con enzimi di restrizioni (enzimi che tagliano i filamenti di DNA in siti di restrizione), DNA frammento legatura (la riparazione di discontinuità in molecole di DNA), trasfezione (l'introduzione di acidi nucleici in un corpo cellulare) e la selezione (la scelta dei singoli genomi per la replica). Isolation

Protocolli per l'isolamento di un frammento di DNA, il primo passo nella clonazione molecolare, spesso incorporano una reazione a catena della polimerasi (PMR), che utilizza cicli di riscaldamento e raffreddamento per amplificare frammenti di DNA. Per raggiungere la dimensione sequenza obiettivo, altri protocolli includono sonicazione DNA, reazione enzimatica digestione e l'uso di oligonucleotidi sintetizzati chimicamente. Questi protocolli variano a seconda della grandezza e quantità di DNA isolato necessario.
Legatura

Protocolli per la legatura coinvolgere utilizzando un enzima, la DNA ligasi, per unirsi molecole di DNA con un legame covalente. Protocollo impone unendo frammenti di DNA, il vettore di clonazione, un buffer legatura, la DNA ligasi e acqua sterilizzata in una provetta e incubare una notte a 4 gradi centigradi.
Transfezione

per trasfezione, o DNA infondendo in una cella utilizzando un mezzo non virali, spesso comportano l'iniezione di DNA direttamente nel citoplasma delle cellule. Altri metodi includono l'utilizzo di reagenti chimici, come il fosfato di calcio e lipidi, per fornire il complesso trasfezione attraverso la membrana cellulare. Questo metodo mette alla prova gli effetti della modificazione genetica sul funzionamento di specifici geni.
Selection | Appartamenti

​​selezione, o di screening, protocolli determinano quali cellule svolta con successo il DNA e indicano che le cellule hanno bisogno di isolamento. Una centrifuga raccolti celle contenenti il ​​DNA trasfettato, che vengono poi incubate in un lisozima (un enzima naturale) tampone e trattato con un detergente alcalino, dando le proteine ​​e membrane solubilità. Utilizzando acetato per precipitare le proteine, una centrifuga e filtro garza il supernatante contenente DNA (il liquido solubile restante da un composto centrifugato). Il supernatante viene precipitato con polietilenglicole, centrifugata e sospesa in un tampone di cloruro di cesio e bromuro di etidio. Le macchie bromuro di etidio il DNA secondo la densità, e utilizzando una luce UV a onde lunghe, il DNA inferiore banda viene estratto con una siringa da cinque cc. Una colonna di scambio ionico equilibrata separa il DNA dal bromuro di etidio e cloruro di cesio, e la finale pellet di DNA viene sospeso in una soluzione tampone e rilevato sul gel elettroforesi.