Propagazione di plasmidi ricombinanti

Trovato in alcuni batteri e specie di lievito , plasmidi sono relativamente piccole , anelli di auto-replicazione del DNA situate al di fuori cromosoma principale di una cellula . Essi sono molto utili in ingegneria genetica perché è relativamente facile impiombare geni selezionati da altre specie in plasmidi , trasferirli tra cellule ospiti dagli stessi o differenti specie , e stimolare loro di replicare - o propagano - a molto superiore rispetto - normale - o amplificati - tassi . Plasmidi ricombinanti sono semplicemente quelli che sono stati progettati per contenere geni da altre specie . Soprattutto con propagazione amplificato , plasmidi ricombinanti possono più rapidamente e facilmente esprimono desideri proteine ​​su larga scala industriale . Cose che ti serviranno
plasmidi e geni librerie preesistenti , o plasmidi e geni vi siete isolati dai loro organismi ospiti e giuntate insieme
attrezzature coltura cellulare
agente Amplification ( s) come il cloruro di calcio , scosse elettriche , freddo e caldo , cloramfenicolo , scosse elettriche e /o Taq polimerasi enzima

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scegliere la procedura di amplificazione o le procedure che meglio si adatta al vostro plasmide ricombinante specifico e di accoglienza organismo . Alcune procedure funzionano meglio con alcuni plasmidi e host che con gli altri. Se si lavora con un romanzo, ancora sperimentale plasmide ricombinante e /o stanno provando una diversa specie ospite , potrebbe essere necessario determinare il miglior processo o processi di amplificazione attraverso tentativi ed errori .
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Provate il processo chiamato di trasformazione se le specifiche specie plasmide e cellula ospite potrebbe rispondere ad essa . Raffreddare le cellule e plasmidi a zero gradi C in una soluzione di cloruro di calcio ( CaCl ) . Aumentare rapidamente la temperatura a 37-43 ° C. Questo brusco cambiamento di temperatura fa sì che le membrane cellulari per occupare grandi quantità di plasmide .
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inviare impulsi di energia elettrica ad alta tensione attraverso la soluzione di plasmidi e cellule se elettroporazione è il metodo di amplificazione desideri. Questa tecnica aumenta la permeabilità della membrana cellulare ai plasmidi .
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Scoprire la cultura cellula ospite per bassi livelli di antibiotico cloramfenicolo per generare fino a un centinaio di plasmidi per cellula . Questo metodo sopprime la replicazione dei cromosomi delle principali cellule ospiti mentre indurre replicazione incontrollata del plasmide , incluso il gene impiombato in esso .
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Applicare la reazione a catena della polimerasi o PCR per generare copie plasmidici a molto alti ordini di grandezza . PCR si basa sulla polimerizzazione del DNA , la reazione chimica attraverso cui sequenze genetiche formano in natura . PCR è più spesso catalizzata da un enzima termostabile chiamato Taq polimerasi , estratta da una specie batterica che vive nelle sorgenti calde .