Cellulari di superficie Biotinilazione protocollo

Biotinilazione utilizza la capacità della vitamina biotina solubile legarsi a proteine ​​cellulari . Biotina si lega alla proteina strepavidin ed è pertanto utile in biologia cellulare per visualizzare proteine ​​cellulari . Biotinylation permette l'etichettatura sicuro di proteine ​​rispetto a tecniche come radioattività e non influenza il normale funzionamento della cella . Esso consente ai ricercatori di studiare le proteine ​​cellulari come recettori , e che consente una maggiore comprensione delle malattie e processi di malattia . Etichettatura sospeso Celle

Lavare le cellule in fosfato ghiacciata soluzione salina tamponata ( PBS) per rimuovere i contaminanti . Tamponi contenenti tris e glicina saranno in concorrenza con biotinilazione e dovrebbero essere evitati . Per evitare biotinylating proteine ​​interne , l'etichettatura può essere eseguita a 4 gradi Celsius o in presenza di azide . Risospendere le cellule in PBS e la biotina solubile ,

Etichettatura aderenti Cells solfo - NHS - LC - biotina .

Lavare le cellule in PBS e incubare con un prodotto come solfo - NHS - LC - biotina . Le cellule sono poi raschiate in un piatto e lisate in un buffer contenente il detergente Triton X - 100 e preparate per la visualizzazione .
Preparazione cellule marcate

seguito incubazione , le cellule vengono centrifugati in un pellet e lavato in PBS . Le cellule vengono risospese in PBS e purificati con gel IgG Sepharose . La proteina legata viene diluito in tampone di caricamento e riscaldato a 100 gradi Celsius.
Visualizzare cellule

proteine ​​diluiti possono essere visualizzati con sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide ( SDS- PAGE ) seguito da blotting con la proteina e miscela enzimatica , perossido streptavidina - rafano . Macchie sono visualizzate con una reazione chimica --- chemiluminescenza --- che emette luce . Specificità del biotinilazione può essere confermata con anticorpi per la proteina oggetto di studio.