Salute e malattia
Test per acidi nucleici viene effettuata in diagnostica medica per individuare agenti patogeni , come virus o batteri . Questi test sono molto più rapidi e , quindi , consentono un medico per iniziare il trattamento per un paziente che normalmente avrebbe dovuto attendere la conferma di infezione mediante saggi a base di anticorpi più lunghi e noiosi . Il processo è noto anche come test di amplificazione dell'acido nucleico , e comprende un metodo noto come "reverse transcriptasi amplificazione " mediante reazione a catena della polimerasi . Dal momento che questa è una procedura scientifica altamente specializzata , conoscenze avanzate e le competenze in tecniche di biologia molecolare e serve teoria. Cose che ti serviranno
celle di raccolta con un reagente di estrazione di RNA , come Trizol . 1 ml , è sufficiente per raccogliere le cellule da un pozzetto di una piastra di coltura tissutale sei pozzetti . Le cellule vengono accuratamente pipettati su e giù per omogeneizzare e poi eseguire la procedura di estrazione come descritto nel foglio Trizol . Brevemente , estrarre con cloroformio , poi centrifuga per separare le fasi di DNA , RNA e proteine . Recuperare solo la fase RNA incolore e precipitare che con isopropanolo . Dopo l'incubazione , centrifughe che e ripulire il pellet risultante con diversi lavaggi etanolo . Poi risospendere il pellet in acqua RNase -free.
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Per la trascrizione inversa , denaturare esattamente 5 microgrammi di RNA a 65 gradi Celsius in 10 microlitri ( ul ) volume di acqua RNase-free , quindi rapidamente disporli sul ghiaccio . Per ciascuna reazione , unire 10 ul di RNA , 3 ul di tampone di reazione 10x PCR , 2,5 ul di dNTP 10 millimolare , 6 l di cloruro di magnesio 25 millimolare , 1 ul di primer casuali di 1,8 milligrammi per millilitro concentrazione , e 0,5 ul di SuperScript II enzima trascrittasi inversa . Rabboccare ogni reazione con 17 ul di acqua RNase -free. Incubare le provette a temperatura ambiente per dieci minuti e poi a 42 gradi Celsius per un'ora per produrre il cDNA , poi denaturare a 95 gradi Celsius e rapidamente ghiaccio per fermare la reazione .
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per una reazione a catena della polimerasi , di nuovo impostare una miscela di reazione in provette da 0,5 ml combinando 6 ul di cDNA fatta nella reazione di trascrizione inversa , 1,5 ul di tampone di reazione 10x PCR , 0,2 microlitri di Taq polimerasi , 0,5 microlitri di primer reverse e anche di primer in avanti , poi ricaricare ogni tubo con 10,3 ul di acqua RNase -free. Per eseguire le reazioni , impostare un termociclatore ( cioè una macchina che esegue la reazione a catena della polimerasi ) per 30 cicli come segue : 95 gradi Celsius 0,5 minuto per denaturare , seguita da 60 gradi Celsius per 45 secondi a ricottura , ed infine 72 gradi Celsius per 1 minuto per estendere la trascrizione sintetizzato .